生物素（Biotin）标记效率检测

生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law），又称比尔定律或比耳定（Beer's law），是分光光度法的基本定律，即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时，其吸光度（Absorbance，A）与吸光物质的浓度（Consenreation，C）及吸收层厚度（length，L）成正比, 用公式表示为：A = ε*C* L其中A为光度，ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A 500= ε500 C L（此ε500=34,000M-1cm-1）（4-羟基苯偶氮）苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合，其结合复合物为一种黄色或者橘黄色，在500nm有最大吸光值；但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合，当溶液中存在生物素的时候，生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理，可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量（被标记蛋白与生物素的摩尔比）

实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法：

分光光度法：

A． 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B． 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)<0.35,请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。

微孔酶标板法：

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中，在500nm波长测量吸光值，记录为A_500(H-A);最好测量三次取平均值；

B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白（Biotinylated Protein,简称BP），震荡或移液器吹打充分混匀后，在500nm波长测量吸光值，吸光值稳定20秒以上，记录为A_500(H-A-BP);最好测量三次取平均值；如果A_500(H-A-BP)< 0.3*A_500(H-A),请用PBS稀释待测样品，再次重复此步骤。

标记效率计算方法：

1）蛋白摩尔浓度计算：mM /mL

2）生物素摩尔浓度计算(分光光度计法)：mM /mL

其中吸光值变化(分光光度比色皿)：ΔA₅₀₀=（0.9* A_500(H-A)）- A_500(H-A-BP)

3）生物素摩尔浓度计算（微孔板法）：mM /mL

其中吸光值变化(微孔酶标板)：ΔA₅₀₀=A_500(H-A)- A_500(H-A-BP)

备注：使用标准96孔微孔板，200ul液体，其液面高度（光程）为0.58cm

4）标记摩尔比计算：

生物素：蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

Frdbio® HABA法生物素标记效率检测试剂盒