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生物素(Biotin)标记效率检测

作者:福因德科技(武汉)有限公司 2025-07-10T00:00 (访问量:806)

生物素(Biotin)标记效率检测

生物素标记摩尔比的计算是基于比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law),又称比尔定律或比耳定(Beer's law),是分光光度法的基本定律,即当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的吸光物质时,其吸光度(Absorbance,A)与吸光物质的浓度(Consenreation,C)及吸收层厚度(length,L)成正比, 用公式表示为:A = ε*C* L其中A为光度,ε为摩尔吸光系数,所以此处公式为A 500= ε500 C L(此ε500=34,000M-1cm-1)(4-羟基苯偶氮)苯甲酸(2-(4-Hydroxyphenylazo)benzoic acid ,英文缩写HABA)可以与亲和素特异性结合,其结合复合物为一种黄色或者橘黄色,在500nm有最大吸光值;但是其结合力远远低于生物素与亲和素的结合,当溶液中存在生物素的时候,生物素会强竞争让HABA解离下来,引起吸光值下降。基于此原理,可以根据500nm吸光值的变化计算出蛋白标记生物素的量(被标记蛋白与生物素的摩尔比)

实验操作可以选择分光光度法或微孔酶标板法:

分光光度法:

A. 取900uL HABA- Avidin混合液放入1cm光程比色杯,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;

B. 在比色杯中加入100uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)<0.35,请用PBS稀释待测样品,再次重复此步骤。

 

微孔酶标板法:

A.      取180uL HABA- Avidin混合液放入微孔板中,在500nm波长测量吸光值,记录为A500(H-A);最好测量三次取平均值;

B.      在微孔板中加入20uL待测的生物素标记蛋白(Biotinylated Protein,简称BP),震荡或移液器吹打充分混匀后,在500nm波长测量吸光值,吸光值稳定20秒以上,记录为A500(H-A-BP);最好测量三次取平均值;如果A500(H-A-BP)< 0.3*A500(H-A),请用PBS稀释待测样品,再次重复此步骤。

标记效率计算方法:

1)蛋白摩尔浓度计算:mM /mL

2)生物素摩尔浓度计算(分光光度计法):mM /mL

其中吸光值变化(分光光度比色皿):ΔA500=(0.9* A500(H-A))- A500(H-A-BP)

3)生物素摩尔浓度计算(微孔板法):mM /mL

其中吸光值变化(微孔酶标板):ΔA500=A500(H-A)- A500(H-A-BP)

备注:使用标准96孔微孔板,200ul液体,其液面高度(光程)为0.58cm

 

4)标记摩尔比计算:

生物素:蛋白=[(生物素摩尔浓度*10)/蛋白原始摩尔浓度]*稀释倍数

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